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Quali approcci potrebbero accelerare lo screening su larga scala?

Testo aggiornato al 2020-11-01


La tracciabilità dei casi richiede l'accelerazione e la generalizzazione dei test di screening su larga scala. Sono già disponibili test semplici e rapidi come alternativa ai test di riferimento (tampone rinofaringeo e misurazione tramite « RT-qPCR »): 1) per rendere il campionamento semplice, autonomo, senza rischio di contaminazione e poco invasivo: il campionamento può essere basato sulla saliva che contiene molto virus (vedi « Quale campione testare per la presenza di coronavirus: rinofaringeo o orale ? ») ; 2) al fine di ridurre la durata del test, i metodi di rilevazione rapida consentono di individuare direttamente gli antigeni del virus (i cosiddetti test "antigenici"). Per non perdere casi con una bassa carica virale, esiste un altro test con una rapida fase di amplificazione: si tratta del metodo « RT-LAMP »; 3) per ridurre il numero di test da effettuare per rilevare i casi su larga scala COVID-19, dobbiamo pianificare di combinare i campioni in gruppi, un metodo noto come « pooling ». Vedi « Raggruppare i test (“ pooling ”): perché e per cosa? ».

NOTA: È necessario distinguere tra i test virali in grado di stabilire se si è attualmente infettati dal virus (vedere "Qual è il test di riferimento per scoprire se sono infettato dal CoV-2-SARS? ) e i test sierologici che ti dicono che sei stato infettato dal virus rilevando la tua risposta immunitaria (vedi « Quali sono i test per scoprire se ho già avuto la COVID-19 ? »).

I test per il rilevamento del virus nelle secrezioni del nostro corpo possono essere resi molto sensibili mediante un processo di amplificazione del virus (metodo PCR o RT-LAMP), oppure essere poco sensibili se il virus viene rilevato direttamente senza amplificazione del virus (i cosiddetti test "antigenici").

Saliva: un metodo di raccolta semplice e autonomo, meno soggetto a contaminazione. Recentemente, i test basati sull'analisi della saliva si sono dimostrati sensibili a causa dell'elevata carica virale. Poiché la raccolta della saliva è facile, gli individui possono campionare la propria saliva.

Sorprendentemente, il virus è molto stabile nella saliva: resiste più di una settimana a temperatura ambiente, più di 2 settimane a 4°C e mesi in congelatore a -80°C. Così, il sistema per la raccolta di campioni di saliva può essere semplice ed economico.

Per tutti questi motivi, i test sulla saliva sono molto promettenti per test rapidi e su larga scala. Vedi la domanda " Quale campione testare per la presenza di coronavirus: rinofaringeo o orale? ».

Fare meno test per identificare i casi positivi e ridurre il costo dei test raggruppando i campioni. La combinazione di campioni provenienti da più persone nella stessa famiglia in un unico pool potrebbe ottimizzare l'individuazione di focolai infetti nella popolazione. Vedi le domande « Raggruppare i test (pooling): perché e per cosa? » e «Quali sono i rischi di falsi negativi nei test collettivi ? ». La tecnica del pooling dei campioni riduce il numero di test PCR standard che devono essere eseguiti e quindi fa risparmiare tempo ed efficienza nel rilevamento dei casi, oltre a ridurre i costi. E' possibile mettere in comune i campioni, testare i pool e, in caso di positività, testare nuovamente i singoli individui separatamente.

Rilevazione del virus mediante una rapida amplificazione della sequenza virale per lo screening individuale e collettivo: il metodo RT-LAMP e la speranza dell'approccio LAMP-seq. 

Esistono test basati sulla Polymerase Chain Reaction ("PCR") che sono più veloci di RT-qPCR come RT-LAMP che è una tecnica di amplificazione isotermica mediata da loop che può essere eseguita in mezz'ora. Questo metodo può essere utilizzato per lo screening individuale ed è commercializzato in Francia per i campioni di saliva dalla società SkillCell (test "EasyCov").

Il metodo RT-LAMP è stato adattato in una recente prova di concetto per lo screening su larga scala: l'approccio LAMPseq. Aggiungendo "codici a barre" nel campione di ogni individuo, è possibile combinare campioni di più individui (fino a diverse decine di migliaia) e identificare il risultato di ciascuno in un unico test! Il codice a barre è una piccola sequenza di DNA attaccata ai primer che vengono utilizzati per amplificare il genoma del virus. Quindi, se uno dei campioni contiene il coronavirus, la sequenza virale verrà amplificata contemporaneamente al codice a barre di identificazione dell'individuo. Attraverso un massiccio sequenziamento, è possibile rintracciare il virus fino alla persona che lo trasporta all'interno della piscina. Il "LAMPseq" richiede necessariamente più tempo della mezz'ora di RT-LAMP per elaborare le decine di migliaia di campioni, per sequenziare e interpretare le sequenze. D'altra parte, con questo approccio non è necessario ripetere i test sugli stessi campioni, poiché l'identità di ogni individuo nel pool di campioni è nota grazie al codice a barre. Si noti che il tasso di positività dei casi COVID-19 nella popolazione testata impongono vincoli sul numero di campioni da mettere in comune con questo metodo.

Trovare rapidamente casi positivi altamente contaminanti rilevando le molecole presenti sulla superficie del virus: test antigenici a bassa sensibilità ma rapidi. Mentre i test PCR rilevano il materiale genetico del SARS-CoV-2 (RNA), i test antigenici rilevano le molecole presenti sulla superficie del virus, solitamente la proteina nucleocapside. Questi test sono rapidi (meno di 30 minuti) e possono quindi essere utili per individuare persone con un'elevata carica virale che potrebbero infettare efficacemente durante un evento di massa. Questi test sono altamente specifici per il virus, ma non sono così sensibili come le misure basate sulla PCR che rilevano la sequenza del virus dopo un processo di amplificazione. Pertanto, con questi test antigenici, vi è un rischio maggiore di commettere errori del tipo falsi negativi. A causa della bassa sensibilità di questi test, gli individui sintomatici o i casi di contatto con un test antigenico negativo sono incoraggiati a confermare i loro risultati con un test PCR più sensibile.


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Fonti

Uno dei primi studi che indicano l'affidabilità dei test sulla saliva.

Azzi, L., Carcano, G., Gianfagna, F., Grossi, P., Dalla Gasperina, D., Genoni, A., ... & Maurino, V. (2020). Saliva is a reliable tool to detect SARS-CoV-2. Journal of Infection.

Uno dei primi studi che indicano l'affidabilità dei test sulla saliva.

Williams, E., Bond, K., Zhang, B., Putland, M., Williamson, D.A. (2020) Saliva as a non-invasive specimen for detection of SARS-CoV-2. J Clin Microbiol. pii: JCM.00776-20.

I ricercatori dell'Università di Yale dimostrano che i test della saliva sono più sensibili di quelli eseguiti su campioni rinofaringei (n = 70 pazienti COVID):

Wyllie, A. L., Fournier, J., Casanovas-Massana, A., Campbell, M., Tokuyama, M., Vijayakumar, P., ... & Petrone, M. E. (2020). Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID-19 patients than nasopharyngeal swabs. New England Journal of Exp. Medecine, Sept 24 2020, 383: 1283-1286.

Il virus è stabile nella saliva per più di una settimana a temperatura ambiente, più di 2 settimane a 4°C e mesi nel congelatore a -80°C. Queste osservazioni suggeriscono che un sistema di raccolta semplice ed economico è possibile:

Ott, IM, Strine, MS, Watkins, AE, Boot, M, Kalinich, CC, Harden, CA, Vogels, CBF, Casanovas-Massana, A, Moore, AJ, Muenker, MC, Nakahata, M, Tokuyama, M, Nelson, A, Fournier, J, Bermejo, S, Campbell, M, Datta, R, Dela Cruz, CS, Farhadian, SF, Ko, AI, Iwasaki, A, Grubaugh, ND, Wilen, CB, Wyllie, AL. Simply saliva: stability of SARS-CoV-2 detection negates the need for expensive collection devices.

Lo studio francese COVISAL, condotto nella foresta amazzonica della Guyana francese, dimostra l'interesse e la facilità del prelievo di saliva. Lo studio sul campo rivela variazioni tra i gruppi campionati in condizioni di laboratorio (Yale University, Hokkaido University) e sul campo. Questo studio, basato su 25 casi asintomatici, ha portato l'Haute Autorité de Santé ad effettuare test sulla saliva solo su persone sintomatiche (https://www.has-sante.fr/jcms/p_3202317/fr/covid-19-les-tests-salivaires-peuvent-completer-les-tests-nasopharynges-chez-les-personnes-symptomatiques).

Nacher, M, Mergeay-Fabre, M, Blanchet, D, Benois, O, Pozl, T, Mesphoule, P, Sainte-Rose, V, Vialette, V, Toulet, B, Moua, A, Simon, S, Guidarelli, M, Galindo, M, Biche, B, Faurous, W, Abad, F, Fahrasmane, A, Rochemont, D, Vignier, N, Vabret, A, Demar, M. COVISAL Guyane, Nacher, M, Demar, M. Prospective comparison of saliva and nasopharyngeal swab sampling for mass screening for COVID-19. COVISAL Guyane, Nacher, M, Demar, M. Prospective comparison of saliva and nasopharyngeal swab sampling for mass screening for COVID-19.

La messa in comune dei campioni all'interno di una famiglia potrebbe ottimizzare l'individuazione di focolai infetti nella popolazione:

Hogan, C. A., Sahoo, M. K., & Pinsky, B. A. (2020). Sample Pooling as a Strategy to Detect Community Transmission of SARS-CoV-2. JAMA.

Un recente studio giapponese su 55 casi asintomatici di COVID dimostra che la saliva è un metodo di raccolta molto efficiente per rilevare il CoV-2-SARS anche in pazienti asintomatici: 92% di sensibilità mediante la raccolta della saliva e 86% di sensibilità mediante il campionamento nasofaringeo, con una probabilità di accordo del 99,8%. I test sono stati effettuati su più di 1950 persone di contatto o all'arrivo negli aeroporti:

Yokota, I, Shane, P, Okada, K, Unoki, Y, Yang Y, Tasuku, I, Sakamaki, K, Iwasaki, S, Hayasaka, K, Sugita, J, Nishida, M, Fujisawa, S, Teshima, T. (2020). Mass screening of asymptomatic persons for SARS-CoV-2 using saliva. 10.1101/2020.08.13.20174078.

Uno studio giapponese su 103 casi positivi, che confronta diversi sistemi RT-qPCR e un sistema RT-LAMP, conclude che la sensibilità di RT-qPCR è migliore. Si noti che in questo studio non c'è stato alcun pretrattamento della saliva prima della RT-LAMP, che potrebbe influenzare i risultati ottenuti.

Ikeda, M, Imai, K, & Tabata, S, Miyoshi, K, Mizuno, T, Murahara, N, Horiuchi, M, Kato, K, Imoto, Y, Iwata, M, Mimura, S, Ito, T & Tamura, K, Kato, Y. (2020). Clinical evaluation of self-collected saliva by RT-qPCR, direct RT-qPCR, RT-LAMP, and a rapid antigen test to diagnose COVID-19. 10.1101/2020.06.06.20124123.

Il kit di rilevamento EasyCOV, che utilizza RT-LAMP dopo il pretrattamento della saliva, permette il rilevamento il SARS-Cov-2 in 40 minuti con una sensibilità dell'87,5% secondo il loro primo studio effettuato su 220 persone.

Un totale di 720 persone dovrebbe essere integrato entro la fine dello studio.

La tecnica LAMP-Seq è stata sviluppata e validata su un gruppo di 28 individui, 12 dei quali erano positivi alla RT-PCR. 12 individui su 12 sono stati identificati come positivi con l'approccio LAMP-Seq. I tassi di falsi negativi e falsi positivi dipenderanno dalle precise condizioni di attuazione e impongono vincoli sul tasso massimo di casi positivi nella popolazione considerata:

Schmid-Burgk, JL, Schmithausen, RM, Li, D, Hollstein, R, Ben-Shmuel, A, Israeli, O, Weiss, S, Paran, N, Wilbring, G, Liebing, J, Feldman, D, Słabicki, M, Lippke, B, Sib, E, Borrajo, J, Strecker, J, Reinhardt, J, Hoffmann, P, Cleary, P, Hölzel, M, Nöthen, MM, Exner, M, Ludwig, KU, Regev, A, Zhang, F. LAMP-Seq: Population-Scale COVID-19 Diagnostics Using Combinatorial Barcoding.

Test raggruppati da 5 a 20 in campioni di saliva fatti dal team dell'Università di Yale anche all'origine del test SalivaDirect:

Watkins, A. E., Fenichel, E. P., Weinberger, D. M., Vogels, C. B., Brackney, D. E., Casanovas-Massana, A., ... & Cruz, C. S. D. (2020). Pooling saliva to increase SARS-CoV-2 testing capacity. medRxiv.

Test collettivi da 5 a 30 in Germania, nel Saarland, per la prevenzione delle epidemie:

Lohse, S., Pfuhl, T., Berkó-Göttel, B., Rissland, J., Geißler, T., Gärtner, B., ... & Smola, S. (2020). Pooling of samples for testing for SARS-CoV-2 in asymptomatic people. The Lancet Infectious Diseases

Uno studio esamina la specificità e la sensibilità del test antigenico rapido "Coris COVID-19 Ag Respi-Strip" su 106 campioni: se il test è specifico (100%), il tasso di rilevazione dei casi positivi è molto basso (30%).

Scohy, A., Anantharajah, A., Bodéus, M., Kabamba-Mukadi, B., Verroken, A., & Rodriguez-Villalobos, H. (2020). Low performance of rapid antigen detection test as frontline testing for COVID-19 diagnosis. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology, 129, 104455.

Uno studio giapponese che ha esaminato le prestazioni del test antigenico LUMILUSTRE su 313 campioni ha rivelato che questi test sono altamente specifici per il SARS-CoV-2 (specificità del 99,6%) ma non molto sensibili (sensibilità del 55,2% rispetto ai test PCR per il rilevamento del virus).

Hirotsu, Y, Maejima, M, Shibusawa, M, Nagakubo, Y, Hosaka, K, Amemiya, K, Sueki, H, Hayakawa, M, Mochizuki, H,Tsutsui, T, Kakizaki, Y, Miyashita, Y, Yagi, S, Kojima, S, Omata, M. Comparison of automated SARS-CoV-2 antigen test for COVID-19 infection with quantitative RT-PCR using 313 nasopharyngeal swabs, including from seven serially followed patients. Int J Infect Dis. 2020 Oct; 99: 397–402. doi: 10.1016/j.ijid.2020.08.029

I test immunologici a fluorescenza rapida dell'antigene del SARS CoV-2 possono identificare i pazienti entro i primi 5 giorni dall'insorgenza del sintomo quando le secrezioni respiratorie portano elevate cariche virali, suggerendo che questi test potrebbero svolgere un ruolo importante nelle future strategie indipendenti dalla PCR per individuare casi precoci o infettivi:

Porte, L, Legarraga, P, Iruretagoyena, M, Vollrath, V, Pizarro, G, Munita, JM, Araos, R, Weitzel, T. Rapid SARS-CoV-2 antigen detection by immunofluorescence – a new tool to detect infectivity

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