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Cosa testare per rilevare il COVID-19: tamponi nasofaringei o prelevamenti orali?

Testo aggiornato al 2020-06-03


I prelevamenti orali sono preferibili perché consentono un campionamento autonomo, sono più facili e meno pericolosi in termini di contaminazione. Stati Uniti, Giappone, Svizzera, Australia, Italia e Regno Unito li utilizzano.

Sebbene il tampone nasofaringeo sia stato il test di riferimento fin dall'inizio dell'epidemia, molti paesi stanno utilizzando anche prelevamenti orali, che comportano meno rischi per gli operatori sanitari e non richiedono dispositivi di protezione personale.

Numerosi studi, effettuati in Italia, Australia, Hong Kong, Bangkok, Giappone e Stati Uniti (Connecticut e California) dimostrano che il coronavirus SARS-CoV-2 è rilevabile in tamponi orali per diverse settimane dopo l'insorgenza dei sintomi e nella saliva dei casi asintomatici. Dopo la fluidificazione e l'estrazione dell'RNA virale, la sensibilità di rilevazione è buona come con i tamponi rinofaringei, poiché la carica virale è elevata e viene utilizzata la stessa tecnica di PCR. Si raccomanda di tenere il paziente giovane per 2 ore prima del prelievo. In queste condizioni, il coronavirus rimane tipicamente nella saliva per 4-5 settimane, più a lungo di quanto si trova tipicamente nel tampone nasale. 

In pratica, i prelevamenti orali vengono effettuati in diversi modi: 

Lo sputo sembra essere la sostanza più affidabile per rilevare il SARS-CoV-2, ma devono ancora essere effettuati studi sistematici che mettano a confronto i vari metodi. Poiché il SARS-CoV-2 risiede nelle vie aeree, lo sputo salivare può consentire la raccolta di fluidi da bocca e bronchi nello stesso campione, aumentando così le possibilità di rilevamento del coronavirus.

I prelievi orali hanno vantaggi pratici rispetto ai tamponi rinofaringei:

(1) È molto facile raccogliere la saliva o l'espettorato. Questo campione può essere custodito da coloro che sono stati sottoposti al test, compresi i bambini, senza esporre gli altri al coronavirus. Al contrario, il tampone nasofaringeo è delicato e invasivo e può causare dolore o disagio. Spesso porta a starnuti o tosse, che espongono la persona che preleva il campione a un rischio significativo di contaminazione e la costringono a proteggersi. È difficile proporre ripetutamente il tampone rinofaringeo.

(2) non sono necessarie apparecchiature specifiche per la raccolta della saliva. Il materiale per i prelievi rinofaringei (tamponi) e la protezione dell'addetto (camice, mascherina FFP2, guanti, copricapo) è un fattore limitante per l'esecuzione di test su larga scala. 


Diversi studi recenti di alta qualità dimostrano che la carica virale è altrettanto importante nella saliva che sul tampone nasofaringeo tra casi asintomatici e sintomatici e che il rilevamento nei pazienti asintomatici è altrettanto buono nella saliva che sul tampone nasofaringeo. Per un test di screening facile, senza pericolo di contaminazione e meno invasivo: optiamo per la saliva!


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Fonti

Un gran numero di particelle virali si trova nella saliva raccolta dai pazienti stessi a Hong Kong. Questo numero diminuisce nel corso della malattia e scompare 8-10 giorni dopo i primi sintomi. Su 23 pazienti, 3 sono stati trovati negativi nella saliva. In questo studio il test PCR è un test fatto in casa e la saliva era raccolta al mattino dopo essersi schiariti la gola ed aver tossito.

To, K. K. W., Tsang, O. T. Y., Yip, C. C. Y., Chan, K. H., Wu, T. C., Chan, J. M. C., ... & Lung, D. C. (2020). Consistent detection of 2019 novel coronavirus in saliva. Clinical Infectious Diseases.

A Melbourne, 39 pazienti su 622 sono risultati positivi al tampone rinofaringeo e 33 di questi 39 sono risultati positivi anche alla saliva. Tra i 50 negativi al tampone, la saliva era positiva in uno. In questo studio, i pazienti hanno trattenuto la saliva per 1 o 2 minuti prima di sputare da 1-2 ml. L'85% dei pazienti positivi al tampone aveva il virus SARS-CoV-2 anche nella saliva. La quantità di RNA rilevata era inferiore nella saliva che nel tampone. Tuttavia, i risultati dei test PCR non possono essere direttamente confrontati in quanto non sono fatti esattamente nello stesso modo. In particolare, la saliva deve essere prima diluita in un fluidificante prima dell'estrazione dell'RNA virale. E nella maggior parte degli studi come questo gli autori non normalizzano i risultati con un controllo del prelievo (un gene umano quantificato con PCR che permetta di conoscere la quantità di cellule umane raccolte nel campione).

Williams, E., Bond, K., Zhang, B., Putland, M., & Williamson, D. A. (2020). Saliva as a non-invasive specimen for detection of SARS-CoV-2. Journal of Clinical Microbiology

La saliva di 25 pazienti gravemente malati nel reparto di terapia intensiva  Covid-19 di Varese conteneva un gran numero di copie del virus SARS-Cov-2. In questo studio, la saliva è stata recuperata dalla bocca del paziente utilizzando una pipetta. Per due pazienti il test sulla saliva è risultato positivo, ma non il tampone. Quest'ultimo quindi sembra essere un test meno sensibile. Un recente studio di questo gruppo di ricerca conferma altri due pazienti la cui saliva risultava positiva, ma il cui tampone era invece negativo.

Azzi, L., Carcano, G., Gianfagna, F., Grossi, P., Dalla Gasperina, D., Genoni, A., ... & Maurino, V. (2020). Saliva is a reliable tool to detect SARS-CoV-2. Journal of Infection.

La sensibilità e la specificità del test RT-PCR sulla saliva sono state misurate rispettivamente 84% e 99%, utilizzando il tampone rinofaringeo come riferimento, in 200 pazienti di un ospedale di Bangkok. In questo studio, il campione buccale è stato recuperato dopo una tosse forzata.

Pasomsub, E., Watcharananan, S. P., Boonyawat, K., Janchompoo, P., Wongtabtim, G., Suksuwan, W., ... & Phuphuakrat, A. (2020). Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease-2019 (COVID-19): a cross-sectional study. Clinical Microbiology and Infection.

In un gruppo di 88 pazienti e 24 convalescenti non ricoverati, in California, la sensibilità del test sulla saliva è stata confrontata con quella del tampone. Degli 88 pazienti, il 98% era positivo al tampone e il 69% al test sulla saliva. Dei 24 convalescenti, 4 erano positivi al test sulla saliva e al tampone, 5 erano positivi al tampone ma negativi al test sulla saliva e 1 l'opposto. I limiti di questo studio includono la mancanza di dati clinici sui pazienti, il fatto che i test sono stati eseguiti in 3 luoghi diversi e che la saliva è stata raccolta con due diversi kit. Lu, J., Becker, D., Sandoval, E., Amin, A., De Hoff, P., Leonetti, N., ... & Grzymski, J. (2020). Saliva is less sensitive than nasopharyngeal swabs for COVID-19 detection in the community setting. medRxiv

Lu, J., Becker, D., Sandoval, E., Amin, A., De Hoff, P., Leonetti, N., ... & Grzymski, J. (2020). Saliva is less sensitive than nasopharyngeal swabs for COVID-19 detection in the community setting. medRxiv.

In 76 soggetti (10 pazienti e 66 sospetti), la saliva è stata raccolta in una provetta e il virus è stato rilevato con un test PCR. 8 dei 10 pazienti erano positivi al tampone e alla saliva, 1 positivo al tampone e negativo alla saliva, e 1l'ultimo il contrario.

Iwasaki, S., Fujisawa, S., Nakakubo, S., Kamada, K., Yamashita, Y., Fukumoto, T., ... & Hayasaka, K. (2020). Comparison of SARS-CoV-2 detection in nasopharyngeal swab and saliva. medRxiv.

Una meta-analisi di circa dieci articoli sulla rilevazione del SARS-CoV-2 nella saliva, che evidenzia la difficoltà di confronto date le differenze nei metodi di estrazione, nei kit per il test PCR e nella qualità dei campioni: saliva, espettorato o campioni orofaringei.

Santosh, T. S., Parmar, R., Anand, H., Srikanth, K., & Saritha, M. (2020). A review of salivary diagnostics and its potential implication in detection of Covid-19. Cureus, 12(4).

La start-up CURATIVE a Los Angeles ha ricevuto l'approvazione della Food and Drug Administration (FDA) per dei test dei fluidi orali che danno risultati in 24 ore, con l'obiettivo di un milione di test alla settimana. Il test dovrebbe essere utilizzato anche nel Regno Unito. La Food and Drug Administration (FDA) aveva già approvato il primo test per il SARS-CoV-2 su campioni di saliva sviluppato dalla Rutgers University nel New Jersey. Un kit dedicato viene spedito al paziente, che ci sputa più volte e lo restituisce entro 48 ore al  Rutgers Clinical Genomics Laboratory, che esegue la PCR.

Start-up Curative.

In Francia, il consorzio SKILLCELL, il laboratorio CNRS SYS2DIAG e la società VOGO annunciano l'industrializzazione di EasyCov, un test di screening della saliva che sarà commercializzato in Francia e in Europa a giugno. In meno di un'ora il test si effettua su saliva miscelata con dei reagenti e incubata a 65°C per 30 min.

L’Helgouach, N, Champigneux, P, Santos Schneider, F, Molina, L, Espeut, J, Alali, M, Baptiste, J, Cardeur, L, Dubuc, B, Foulongne, V, Galtier, F, Makinson, A, Marin, G, Picot, MC, Prieux‐Lejeune, A, Quenot, M, Robles, FC, Salvetat, N, Vetter, D, Reynes, J, Molina, F. EasyCOV : LAMP based rapid detection of SARS‐CoV‐2 in saliva.

Questo studio riporta il confronto tra prelievi salivari e tamponi rinofaringei su 145 campioni raccolti contemporaneamente il giorno della diagnosi e 2 e 7 giorni dopo. Dei 145 campioni, 19 sono risultati positivi per la saliva e 19 per il rinofaringeo. Per i soggetti con COVID-19, la saliva appare come un muco molto facile da raccogliere in autonomia e buono almeno quanto il campione rinofaringeo per rilevare il SARS-CoV-2.

Byrne, RL, Kay, GA, Kontogianni, K, Brown, L, Collins, AM, Cuevas, LE, Ferreira, D, Fraser, AJ, Garrod, G, Hill, H, Menzies, S, Mitsi, E, Owen, SI, Williams, CT, Hyder-Wright, A, Adams, ER, Cubas-Atienzar, AI. Saliva offers a sensitive, specific and non-invasive alternative to upper respiratory swabs for SARS-CoV-2 diagnosis. MedRxiv, July 11 2020.

Uno dei primi studi pubblicati dai gruppi di carità in Germania mostra che i risultati sul PNP e sull'espettorato sono molto simili (tutti e 7 i pazienti vengono seguiti nel tempo dopo l'insorgenza dei sintomi). Si noti che il virus rimane nell'espettorato dopo la fine dei sintomi e che il coronavirus non è stato trovato infettivo nelle feci. Il rilevamento del virus nella saliva e nelle secrezioni respiratorie può durare più tempo che il perdurare dei sintomi:

Wölfel, R, Corman, VM, Guggemos, W, Seilmaier, M, Zange, S, Müller, MA, Niemeyer, D, Jones, TC, Vollmar, P, Rothe, C, Hoelscher, M, Bleicker, T, Brünink, S, Schneider, J, Ehmann, R, Zwirglmaier, K, Drosten, C, & Wendtner, C. Valutazione virologica dei pazienti ospedalizzati con COVID-2019. Volume Nature 581, pagine 465-469 (2020).

Una meta-analisi di una decina di articoli sulla rilevazione di SARS-CoV-2 nella saliva, evidenziando la difficoltà di confronto date le variazioni dei metodi di estrazione, la PCR con l'uso di vari kit e la qualità dei campioni: saliva, espettorato o campioni orofaringei.

Santosh, T. S., Parmar, R., Anand, H., Srikanth, K., & Saritha, M. (2020). A review of salivary diagnostics and its potential implication in detection of Covid-19. Cureus, 12(4).

Start-up CURATIVE a Los Angeles ha ricevuto l'approvazione della Food and Drug Administration (FDA) per il test 24 ore su 24 dei fluidi orali, con l'obiettivo di un milione di test alla settimana. Il test dovrebbe essere utilizzato anche nel Regno Unito. La Food and Drug Administration (FDA) aveva già approvato il primo test di SARS-CoV-2 sui campioni di saliva sviluppati dalla Rutgers University nel New Jersey.

Un kit dedicato viene inviato al paziente che sputa più volte e poi lo rispedisce entro 48 ore al Laboratorio di Genomica Clinica Rutgers che esegue le PCR.

Il kit di rilevamento EasyCOV che utilizza RT-LAMP dopo il pretrattamento della saliva permette il rilevamento di SARS-CoV-2 in 40 minuti con una sensibilità dell'87,5% secondo il loro primo studio effettuato su 220 persone.

Un totale di 720 persone dovrebbe essere integrato entro la fine dello studio.

I ricercatori dell'Università di Yale dimostrano che i test della saliva sono più sensibili di quelli eseguiti su campioni rinofaringei (n = 70 pazienti COVID):

Wyllie, A. L., Fournier, J., Casanovas-Massana, A., Campbell, M., Tokuyama, M., Vijayakumar, P., ... & Petrone, M. E. (2020). Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID-19 patients than nasopharyngeal swabs. New England Journal of Exp. Medecine, Sept 24 2020, 383: 1283-1286.

Il virus è stabile nella saliva per più di una settimana a temperatura ambiente, più di 2 settimane a 4°C e mesi nel congelatore a -80°C. Queste osservazioni suggeriscono che un sistema di raccolta semplice ed economico è possibile:

Ott, IM, Strine, MS, Watkins, AE, Boot, M, Kalinich, CC, Harden, CA, Vogels, CBF, Casanovas-Massana, A, Moore, AJ, Muenker, MC, Nakahata, M, Tokuyama, M, Nelson, A, Fournier, J, Bermejo, S, Campbell, M, Datta, R, Dela Cruz, CS, Farhadian, SF, Ko, AI, Iwasaki, A, Grubaugh, ND, Wilen, CB, Wyllie, AL. Simply saliva: stability of SARS-CoV-2 detection negates the need for expensive collection devices.

Lo studio francese COVISAL, condotto nella foresta amazzonica della Guyana francese sul campo in condizioni poco chiare, rivela variazioni tra i gruppi campionati in condizioni di laboratorio (Università di Yale, Università di Hokkaido) e sul campo. Questo studio basato su 25 casi asintomatici contraddice diversi studi internazionali. Tuttavia, alla fine di settembre 2020, ha portato l'Autorità nazionale francese per la salute ad effettuare test della saliva solo su persone con sintomi.

Nacher, M, Mergeay-Fabre, M, Blanchet, D, Benois, O, Pozl, T, Mesphoule, P, Sainte-Rose, V, Vialette, V, Toulet, B, Moua, A, Simon, S, Guidarelli, M, Galindo, M, Biche, B, Faurous, W, Abad, F, Fahrasmane, A, Rochemont, D, Vignier, N, Vabret, A, Demar, M. COVISAL Guyane, Nacher, M, Demar, M. Confronto prospettico tra il prelievo di saliva e il prelievo di tamponi nasofaringei per lo screening di massa per COVID-19.

La messa in comune dei campioni all'interno di una famiglia potrebbe ottimizzare l'individuazione di focolai infetti nella popolazione:

Hogan, C. A., Sahoo, M. K., & Pinsky, B. A. (2020). Sample Pooling as a Strategy to Detect Community Transmission of SARS-CoV-2. JAMA.

Un recente studio giapponese con 55 casi asintomatici COVID dimostra che la saliva è un metodo molto efficace per raccogliere campioni per rilevare SARS-CoV-2 anche in pazienti asintomatici:

Sensibilità del 92% per il campionamento salivare e dell'86% per il campionamento rinofaringeo, con una probabilità di accordo del 99,8%. I test sono stati effettuati su più di 1950 persone in contatto o all'arrivo negli aeroporti: Yokota, I, Shane, P, Okada, K, Unoki, Y, Y, Yang Y, Tasuku, I, Sakamaki, K, Iwasaki, S, Hayasaka, K, Sugita, J, Nishida, M, Fujisawa, S, Teshima, T. (2020). Screening di massa di persone asintomatiche per SARS-CoV-2 utilizzando la saliva. 10.1101/2020.08.13.20174078.

Uno studio giapponese su 103 casi positivi, che confronta diversi sistemi RT-qPCR e un sistema RT-LAMP, conclude che la sensibilità di RT-qPCR è migliore. Si noti che in questo studio non c'è stato alcun pretrattamento della saliva prima della RT-LAMP, che potrebbe influenzare i risultati ottenuti.

Ikeda, M, Imai, K, & Tabata, S, Miyoshi, K, Mizuno, T, Murahara, N, Horiuchi, M, Kato, K, Imoto, Y, Iwata, M, Mimura, S, Ito, T & Tamura, K, Kato, Y. (2020). Clinical evaluation of self-collected saliva by RT-qPCR, direct RT-qPCR, RT-LAMP, and a rapid antigen test to diagnose COVID-19. 10.1101/2020.06.06.20124123.

Test raggruppati da 5 a 20 in campioni di saliva fatti dal team dell'Università di Yale anche all'origine del test SalivaDirect:

Watkins, A. E., Fenichel, E. P., Weinberger, D. M., Vogels, C. B., Brackney, D. E., Casanovas-Massana, A., ... & Cruz, C. S. D. (2020). Pooling saliva to increase SARS-CoV-2 testing capacity. medRxiv.

L'Università di Urbana Champaign ha sviluppato test salivari di gruppo (pool) per tutto il suo personale dall'estate 2020 e ha eseguito più di 800'000 test salivari con RT-qPCR al 14 novembre 2020. Se un pool è positivo, il test PCR viene eseguito per ogni persona nel pool.

Ranoa, DR, Olanda, RL, Alnaji, FG, Green, KJ, KJ, Wang, L, Brooke, CB, Burke, MD, Fan, TM, Hergenrother, PJ. Test molecolari a base di saliva per SARS-CoV-2 che bypassa l'estrazione dell'RNA. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.18.159434v1

Un programma di sorveglianza nel campus della Duke negli Stati Uniti ha scoperto, testando gli studenti con la loro saliva, diversi casi COVID-19 il 50% dei quali erano asintomatici con carichi virali talvolta elevati.

Denny TN, Andrews L, Bonsignori M, et al. Implementation of a Pooled Surveillance Testing Program for Asymptomatic SARS-CoV-2 Infections on a College Campus — Duke University, Durham, North Carolina, August 2–October 11, 2020. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. ePub: 17 November 2020. DOI: http://dx.doi.org/10.15585/mmwr.mm6946e1external icon

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